správy

V poslednom desaťročí sa technológia sekvenovania génov široko používa vo výskume rakoviny a klinickej praxi a stala sa dôležitým nástrojom na odhalenie molekulárnych charakteristík rakoviny. Pokroky v molekulárnej diagnostike a cielenej terapii podporili rozvoj konceptov presnej terapie nádorov a priniesli veľké zmeny do celej oblasti diagnostiky a liečby nádorov. Genetické testovanie sa môže použiť na varovanie pred rizikom rakoviny, usmernenie rozhodnutí o liečbe a hodnotenie prognózy a je dôležitým nástrojom na zlepšenie klinických výsledkov pacientov. V tejto práci zhŕňame nedávne články publikované v CA Cancer J Clin, JCO, Ann Oncol a ďalších časopisoch, ktoré sa zaoberajú aplikáciou genetického testovania v diagnostike a liečbe rakoviny.

Somatické mutácie a mutácie zárodočnej línie. Vo všeobecnosti je rakovina spôsobená mutáciami DNA, ktoré môžu byť zdedené od rodičov (mutácie zárodočnej línie) alebo získané s vekom (somatické mutácie). Mutácie zárodočnej línie sú prítomné od narodenia a mutátor zvyčajne nesie mutáciu v DNA každej bunky v tele a môže byť prenesený na potomstvo. Somatické mutácie získavajú jednotlivci v negametických bunkách a zvyčajne sa neprenášajú na potomstvo. Zárodočné aj somatické mutácie môžu zničiť normálnu funkčnú aktivitu buniek a viesť k malígnej transformácii buniek. Somatické mutácie sú kľúčovým faktorom malignity a najprediktívnejším biomarkerom v onkológii; približne 10 až 20 percent pacientov s nádorom však nesie zárodočné mutácie, ktoré významne zvyšujú ich riziko rakoviny, a niektoré z týchto mutácií sú aj terapeutické.
Mutácia vodiča a mutácia cestujúceho. Nie všetky varianty DNA ovplyvňujú funkciu bunky; v priemere je potrebných päť až desať genomických udalostí, známych ako „mutácie vodiča“, na spustenie normálnej degenerácie buniek. Mutácie vodiča sa často vyskytujú v génoch úzko súvisiacich s aktivitami bunkového života, ako sú gény zapojené do regulácie rastu buniek, opravy DNA, kontroly bunkového cyklu a iných životných procesov, a majú potenciál byť použité ako terapeutické ciele. Celkový počet mutácií v akejkoľvek rakovine je však pomerne veľký, od niekoľkých tisíc v niektorých prípadoch rakoviny prsníka až po viac ako 100 000 v niektorých vysoko variabilných kolorektálnych a endometriálnych rakovinách. Väčšina mutácií nemá žiadny alebo obmedzený biologický význam, aj keď sa mutácia vyskytuje v kódujúcej oblasti, takéto nevýznamné mutačné udalosti sa nazývajú „mutácie cestujúceho“. Ak génový variant v konkrétnom type nádoru predpovedá jeho odpoveď na liečbu alebo rezistenciu na liečbu, variant sa považuje za klinicky operabilný.
Onkogény a gény potláčajúce nádory. Gény, ktoré sú často mutované pri rakovine, možno zhruba rozdeliť do dvoch kategórií, onkogény a gény potláčajúce nádory. V normálnych bunkách hrá proteín kódovaný onkogénmi hlavnú úlohu v podpore proliferácie buniek a inhibícii apoptózy buniek, zatiaľ čo proteín kódovaný onkosupresorovými génmi je zodpovedný hlavne za negatívnu reguláciu bunkového delenia s cieľom udržať normálnu funkciu buniek. V procese malígnej transformácie vedie genomická mutácia k zvýšeniu aktivity onkogénov a zníženiu alebo strate aktivity onkosupresorových génov.
Malá variácia a štrukturálna variácia. Toto sú dva hlavné typy mutácií v genóme. Malé varianty menia DNA zmenou, deléciou alebo pridaním malého počtu báz, vrátane inzercie báz, delécie, posunu čítacieho rámca, straty štartovacieho kodónu, straty stop kodónu atď. Štrukturálna variácia je rozsiahla prestavba genómu, ktorá zahŕňa génové segmenty s veľkosťou od niekoľkých tisíc báz až po väčšinu chromozómu, vrátane zmien počtu kópií génov, delécie chromozómov, duplikácie, inverzie alebo translokácie. Tieto mutácie môžu spôsobiť zníženie alebo zvýšenie funkcie proteínov. Okrem zmien na úrovni jednotlivých génov sú súčasťou klinických sekvenčných správ aj genomické signatúry. Genomické signatúry možno vnímať ako komplexné vzorce malých a/alebo štrukturálnych variácií vrátane mutačnej záťaže nádoru (TMB), mikrosatelitovej instability (MSI) a homologických rekombinačných defektov.

Klonálne mutácie a subklonálne mutácie. Klonálne mutácie sú prítomné vo všetkých nádorových bunkách, sú prítomné pri stanovení diagnózy a pretrvávajú aj po ukončení liečby. Preto majú klonálne mutácie potenciál byť použité ako terapeutické ciele pre nádory. Subklonálne mutácie sú prítomné iba v podskupine rakovinových buniek a možno ich zistiť na začiatku diagnózy, ale s následnou recidívou miznú alebo sa objavia až po liečbe. Heterogenita rakoviny sa vzťahuje na prítomnosť viacerých subklonálnych mutácií v jednom druhu rakoviny. Je pozoruhodné, že prevažná väčšina klinicky významných hnacích mutácií vo všetkých bežných druhoch rakoviny sú klonálne mutácie a zostávajú stabilné počas celej progresie rakoviny. Rezistencia, ktorá je často sprostredkovaná subklonmi, nemusí byť zistená v čase diagnózy, ale objaví sa, keď po liečbe dochádza k relapsu.

Tradičná technika FISH alebo bunkový karyotyp sa používa na detekciu zmien na chromozomálnej úrovni. FISH sa dá použiť na detekciu génových fúzií, delécií a amplifikácií a považuje sa za „zlatý štandard“ na detekciu takýchto variantov s vysokou presnosťou a citlivosťou, ale obmedzenou priepustnosťou. Pri niektorých hematologických malignitách, najmä pri akútnej leukémii, sa karyotypizácia stále používa na usmernenie diagnózy a prognózy, ale táto technika sa postupne nahrádza cielenými molekulárnymi testami, ako sú FISH, WGS a NGS.
Zmeny v jednotlivých génoch je možné detegovať pomocou PCR, a to ako real-time PCR, tak aj digitálnou kvapkovou PCR. Tieto techniky majú vysokú citlivosť, sú vhodné najmä na detekciu a monitorovanie malých reziduálnych lézií a umožňujú získať výsledky v relatívne krátkom čase. Nevýhodou je obmedzený rozsah detekcie (zvyčajne detekujú iba mutácie v jednom alebo niekoľkých génoch) a obmedzená je aj možnosť viacerých testov.
Imunohistochémia (IHC) je monitorovací nástroj založený na proteínoch, ktorý sa bežne používa na detekciu expresie biomarkerov, ako sú ERBB2 (HER2) a estrogénové receptory. IHC sa môže použiť aj na detekciu špecifických mutovaných proteínov (ako je BRAF V600E) a špecifických génových fúzií (ako sú fúzie ALK). Výhodou IHC je, že sa dá ľahko integrovať do rutinného procesu analýzy tkanív, takže sa dá kombinovať s inými testami. Okrem toho môže IHC poskytnúť informácie o subcelulárnej lokalizácii proteínov. Nevýhodou je obmedzená škálovateľnosť a vysoké organizačné nároky.
Sekvenovanie druhej generácie (NGS) NGS využíva vysokovýkonné techniky paralelného sekvenovania na detekciu variácií na úrovni DNA a/alebo RNA. Túto techniku ​​možno použiť na sekvenovanie celého genómu (WGS) aj sledovaných génových oblastí. WGS poskytuje najkomplexnejšie informácie o genomických mutáciách, ale jeho klinické využitie čelí mnohým prekážkam vrátane potreby čerstvých vzoriek nádorového tkaniva (WGS zatiaľ nie je vhodný na analýzu vzoriek imobilizovaných formalínom) a vysokých nákladov.
Cielené NGS sekvenovanie zahŕňa sekvenovanie celého exónu a panel cieľového génu. Tieto testy obohacujú oblasti záujmu DNA sondami alebo PCR amplifikáciou, čím obmedzujú množstvo potrebného sekvenovania (celý exóm tvorí 1 až 2 percentá genómu a dokonca aj veľké panely obsahujúce 500 génov tvoria iba 0,1 percenta genómu). Hoci sekvenovanie celého exónu funguje dobre vo formalínom fixovaných tkanivách, jeho náklady zostávajú vysoké. Kombinácie cieľových génov sú relatívne ekonomické a umožňujú flexibilitu pri výbere testovaných génov. Okrem toho sa cirkulujúca voľná DNA (cfDNA) objavuje ako nová možnosť genomickej analýzy pacientov s rakovinou, známa ako tekuté biopsie. DNA do krvného obehu môžu uvoľňovať rakovinové aj normálne bunky a DNA uvoľnená z rakovinových buniek sa nazýva cirkulujúca nádorová DNA (ctDNA), ktorú možno analyzovať na detekciu potenciálnych mutácií v nádorových bunkách.
Výber testu závisí od konkrétneho klinického problému, ktorý sa má riešiť. Väčšinu biomarkerov spojených so schválenými terapiami je možné detegovať pomocou techník FISH, IHC a PCR. Tieto metódy sú vhodné na detekciu malého množstva biomarkerov, ale so zvyšujúcou sa priepustnosťou nezlepšujú účinnosť detekcie a ak sa deteguje príliš veľa biomarkerov, nemusí byť dostatok tkaniva na detekciu. Pri niektorých špecifických druhoch rakoviny, ako je rakovina pľúc, kde je ťažké získať vzorky tkaniva a existuje viacero biomarkerov na testovanie, je lepšou voľbou použitie NGS. Záverom možno povedať, že výber testu závisí od počtu biomarkerov, ktoré sa majú testovať u každého pacienta, a od počtu pacientov, u ktorých sa má biomarker testovať. V niektorých prípadoch je postačujúce použitie IHC/FISH, najmä ak bol cieľ identifikovaný, ako je detekcia estrogénových receptorov, progesterónových receptorov a ERBB2 u pacientok s rakovinou prsníka. Ak je potrebné komplexnejšie preskúmanie genomických mutácií a hľadanie potenciálnych terapeutických cieľov, NGS je organizovanejší a nákladovo efektívnejší. Okrem toho sa NGS môže zvážiť v prípadoch, keď sú výsledky IHC/FISH nejednoznačné alebo nepresvedčivé.

Rôzne usmernenia poskytujú usmernenia o tom, ktorí pacienti by mali byť oprávnení na genetické testovanie. V roku 2020 vydala pracovná skupina ESMO Precision Medicine prvé odporúčania pre testovanie NGS pre pacientov s pokročilým karcinómom, v ktorých odporučila rutinné testovanie NGS pre pokročilý neskvamózny nemalobunkový karcinóm pľúc, karcinóm prostaty, kolorektálny karcinóm, karcinóm žlčovodov a vzorky nádorov vaječníkov. V roku 2024 ESMO na tomto základe aktualizovala odporúčania a odporučila zahrnutie rakoviny prsníka a zriedkavých nádorov, ako sú gastrointestinálne stromálne nádory, sarkómy, rakovina štítnej žľazy a rakovina neznámeho pôvodu.
V roku 2022 sa v klinickom stanovisku ASCO k testovaniu somatického genómu u pacientov s metastatickým alebo pokročilým karcinómom uvádza, že ak je u pacientov s metastatickými alebo pokročilými solídnymi nádormi schválená liečba súvisiaca s biomarkermi, u týchto pacientov sa odporúča genetické testovanie. Napríklad genomické testovanie by sa malo vykonať u pacientov s metastatickým melanómom na skríning mutácií BRAF V600E, pretože inhibítory RAF a MEK sú pre túto indikáciu schválené. Okrem toho by sa genetické testovanie malo vykonať aj v prípade, že existuje jasný marker rezistencie na liek, ktorý sa má pacientovi podať. Napríklad egfrmab je neúčinný pri kolorektálnom karcinóme s mutáciou KRAS. Pri posudzovaní vhodnosti pacienta na sekvenovanie génov by sa mal zohľadniť jeho fyzický stav, komorbidity a štádium nádoru, pretože séria krokov potrebných na sekvenovanie genómu vrátane súhlasu pacienta, laboratórneho spracovania a analýzy výsledkov sekvenovania vyžaduje, aby mal pacient primeranú fyzickú kapacitu a predpokladanú dĺžku života.
Okrem somatických mutácií by sa niektoré druhy rakoviny mali testovať aj na zárodočné gény. Testovanie na zárodočné mutácie môže ovplyvniť rozhodnutia o liečbe rakoviny, ako sú mutácie BRCA1 a BRCA2 pri rakovine prsníka, vaječníkov, prostaty a pankreasu. Zárodočné mutácie môžu mať tiež dôsledky pre budúci skríning a prevenciu rakoviny u pacientov. Pacienti, ktorí sú potenciálne vhodní na testovanie na zárodočné mutácie, musia spĺňať určité podmienky, ktoré zahŕňajú faktory, ako je rodinná anamnéza rakoviny, vek pri diagnóze a typ rakoviny. Mnoho pacientov (až 50 %), ktorí nesú patogénne mutácie v zárodočnej línii, však nespĺňa tradičné kritériá pre testovanie na zárodočné mutácie na základe rodinnej anamnézy. Preto s cieľom maximalizovať identifikáciu nositeľov mutácií Národná komplexná sieť pre rakovinu (NCCN) odporúča, aby všetci alebo väčšina pacientov s rakovinou prsníka, vaječníkov, endometria, pankreasu, kolorektálneho karcinómu alebo prostaty boli testovaní na zárodočné mutácie.
Pokiaľ ide o načasovanie genetického testovania, keďže prevažná väčšina klinicky významných hnacích mutácií je klonálna a relatívne stabilná v priebehu progresie rakoviny, je rozumné vykonať genetické testovanie u pacientov v čase diagnózy pokročilého karcinómu. Pre následné genetické testovanie, najmä po molekulárne cielenej terapii, je testovanie ctDNA výhodnejšie ako DNA nádorového tkaniva, pretože krvná DNA môže obsahovať DNA zo všetkých nádorových lézií, čo je priaznivejšie na získanie informácií o heterogenite nádoru.
Analýza ctDNA po liečbe môže byť schopná predpovedať odpoveď nádoru na liečbu a identifikovať progresiu ochorenia skôr ako štandardné zobrazovacie metódy. Protokoly na použitie týchto údajov na usmernenie rozhodnutí o liečbe však neboli stanovené a analýza ctDNA sa neodporúča, s výnimkou klinických štúdií. ctDNA sa môže použiť aj na posúdenie malých reziduálnych lézií po radikálnej operácii nádoru. Testovanie ctDNA po operácii je silným prediktorom následnej progresie ochorenia a môže pomôcť určiť, či bude pacient mať prospech z adjuvantnej chemoterapie, ale stále sa neodporúča používať ctDNA mimo klinických štúdií na usmernenie rozhodnutí o adjuvantnej chemoterapii.

Spracovanie údajov Prvým krokom v sekvenovaní genómu je extrakcia DNA zo vzoriek pacientov, príprava knižníc a generovanie nespracovaných sekvenčných údajov. Nespracované údaje si vyžadujú ďalšie spracovanie vrátane filtrovania údajov nízkej kvality, ich porovnania s referenčným genómom, identifikácie rôznych typov mutácií pomocou rôznych analytických algoritmov, určenia vplyvu týchto mutácií na transláciu proteínov a filtrovania mutácií zárodočnej línie.
Anotácia génu driver je navrhnutá tak, aby rozlišovala medzi mutáciami drivera a passengera. Mutácie drivera vedú k strate alebo zvýšeniu aktivity génu tumor supresora. Medzi malé varianty, ktoré vedú k inaktivácii génov tumor supresora, patria nezmyselné mutácie, mutácie posunu čítacieho rámca a mutácie kľúčového miesta zostrihu, ako aj menej časté delécie štart kodónu, delécie stop kodónu a široká škála mutácií inzercie/delécie intrónu. Okrem toho, missense mutácie a malé mutácie inzercie/delécie intrónu môžu tiež viesť k strate aktivity génu tumor supresora, keď ovplyvňujú dôležité funkčné domény. Štrukturálne varianty, ktoré vedú k strate aktivity génu tumor supresora, zahŕňajú čiastočnú alebo úplnú deléciu génu a ďalšie genomické varianty, ktoré vedú k deštrukcii čítacieho rámca génu. Malé varianty, ktoré vedú k zvýšenej funkcii onkogénov, zahŕňajú missense mutácie a občasné inzercie/delécie intrónov, ktoré cielia na dôležité funkčné domény proteínov. V zriedkavých prípadoch môže skrátenie proteínu alebo mutácie miesta zostrihu viesť k aktivácii onkogénov. Štrukturálne variácie, ktoré vedú k aktivácii onkogénov, zahŕňajú fúziu génov, deléciu génov a duplikáciu génov.
Klinická interpretácia genomickej variácie hodnotí klinický význam identifikovaných mutácií, t. j. ich potenciálnu diagnostickú, prognostickú alebo terapeutickú hodnotu. Existuje niekoľko systémov hodnotenia založených na dôkazoch, ktoré možno použiť na usmernenie klinickej interpretácie genomickej variácie.
Databáza onkológie precíznej medicíny (OncoKB) v Memorial Sloan-Kettering Cancer Center klasifikuje génové varianty do štyroch úrovní na základe ich prediktívnej hodnoty pre užívanie liekov: úroveň 1/2, biomarkery schválené FDA alebo klinicky štandardné biomarkery, ktoré predpovedajú odpoveď na schválený liek v špecifickej indikácii; úroveň 3, biomarkery schválené alebo neschválené FDA, ktoré predpovedajú odpoveď na nové cielené lieky, ktoré sa v klinických skúškach osvedčili, a úroveň 4, biomarkery neschválené FDA, ktoré predpovedajú odpoveď na nové cielené lieky, ktoré preukázali presvedčivé biologické dôkazy v klinických skúškach. Bola pridaná piata podskupina spojená s rezistenciou na liečbu.
Usmernenia Americkej spoločnosti pre molekulárnu patológiu (AMP)/Americkej spoločnosti pre klinickú onkológiu (ASCO)/Kolégia amerických patológov (CAP) pre interpretáciu somatickej variácie rozdeľujú somatickú variáciu do štyroch kategórií: Stupeň I so silným klinickým významom; Stupeň II s potenciálnym klinickým významom; Stupeň III s neznámym klinickým významom; Stupeň IV, bez známeho klinického významu. Pre rozhodnutia o liečbe sú cenné iba varianty stupňa I a II.
Škála klinickej operability molekulárnych cieľov (ESCAT) od ESMO klasifikuje génové varianty do šiestich úrovní: Úroveň I, ciele vhodné na rutinné použitie; Fáza II, cieľ, ktorý sa stále skúma, sa pravdepodobne použije na skríning populácie pacientov, ktorí by mohli mať z cieľového lieku úžitok, ale na jeho podporu sú potrebné ďalšie údaje. Stupeň III, cielené génové varianty, ktoré preukázali klinický prínos u iných druhov rakoviny; Stupeň IV, iba cielené génové varianty podporené predklinickými dôkazmi; V stupni V existujú dôkazy podporujúce klinický význam zacielenia na mutáciu, ale terapia jedným liekom proti cieľu nepredlžuje prežitie alebo je možné prijať stratégiu kombinovanej liečby; Stupeň X, nedostatok klinickej hodnoty.